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N310全自動(dòng)凱氏定氮儀廣泛用于各種食品、谷物、飼料等樣品的蛋白質(zhì)含量測(cè)定。此法又分為常量、半微量、微量法三種。其測(cè)定原理相同,主要區(qū)別在于常量法的樣品及試劑用量較微量法多。而微量法則具有實(shí)驗(yàn)規(guī)模小，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)。但微量法的準(zhǔn) 確度和精密度比常量法要差一些。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為半微量凱氏定氮法。凱氏定氮法整個(gè)測(cè)定過(guò)程分為消解、蒸餾、滴定三步。要使測(cè)定結(jié)果有更好的正確度、準(zhǔn)確度和精準(zhǔn)度,采用高效的方法和認(rèn)真細(xì)致掌握測(cè)定的每個(gè)步驟、各個(gè)細(xì)節(jié)及相應(yīng)的注意事項(xiàng),就顯得尤為重要。本文就此進(jìn)行深入的探討。

1. 原理 

蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。樣品與硫酸和催化劑一同加熱消化,使蛋白質(zhì)分解,分解生成的胺基與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離,用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù), 即為蛋白質(zhì)含量。

1.1 消化

有機(jī)物中的胺基在強(qiáng)熱和CuSO4、濃H2SO4作用下,消化生成(NH4)2SO4,反應(yīng)式為:2NH-2+ H2SO4+2H+=(NH4)2SO4(其中CuSO4做催化劑)

1.2 蒸餾

在凱氏定氮器中與堿作用,通過(guò)蒸餾釋放出NH3,收集于H3BO3溶液中,反應(yīng)式為:(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O 

1.3 滴定

用已知濃度的H2SO4 (或HCI)標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,根據(jù)H2SO4(或HCI)消耗的量計(jì)算出氮的含量,然后乘以相應(yīng)的換算因子,即得蛋白質(zhì)的含量,反應(yīng)式為: (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

依據(jù)凱氏定氮法,通過(guò)全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定樣品中氮或粗蛋白的方法已得到廣泛的認(rèn)可和使用,以下是自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定魚粉和豆粕中粗蛋白含量的實(shí)驗(yàn)。

2. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

2.1主要試劑的配制40%氫氧化鈉:化學(xué)純400g氫氧化鈉溶于1000mL無(wú)氨蒸餾水中;2%硼酸:分析純20g硼酸溶于1000mL無(wú)氨蒸餾水中;0.1mol/L鹽酸:分析純8.3mL鹽酸定容至1000mL,通過(guò)無(wú)水碳酸鈉標(biāo)定;混合指示劑:把溶解于95%乙醇的0.%l溴甲酚綠溶液5份和溶于95%乙醇的0.1%l甲基紅溶液1份混合而成。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

N310全自動(dòng)凱氏定氮儀;樣品消化爐DS-360石墨消解儀;廢氣吸收裝置。

2.3實(shí)驗(yàn)過(guò)程

稱取約0.2g樣品放入消解管,催化劑硫酸銅和硫酸鉀按1:15質(zhì)量比例混合加入3.2g,量取10mL左右濃硫酸慢慢搖動(dòng)將樣品浸濕。放入DS-360石墨消解儀,通過(guò)曲線加熱升溫至420e,消化1h,樣品呈透明藍(lán)綠色液體,繼續(xù)消化20min消解完成。提升消煮管冷卻,消解的樣品放入格丹納N310全自動(dòng)凱氏定氮儀,關(guān)閉安全門,設(shè)置參數(shù)后儀器自動(dòng)進(jìn)行蒸餾、吸收、滴定、計(jì)算并打印結(jié)果。DS-360石墨消解儀的消解溫度設(shè)置如下:

(1)消化不易起泡的樣品,可選擇直線加熱,預(yù)加溫度設(shè)為380e,消化2h即可。

(2)若易起泡的樣品需采用曲線分段加熱

2.4測(cè)定結(jié)果

樣品測(cè)定結(jié)果見表1。

所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果達(dá)到分析要求,完全符合有關(guān)國(guó)標(biāo)GB/T6432-94。

3.實(shí)驗(yàn)過(guò)程注意事項(xiàng)討論

(1)樣品應(yīng)是均勻的。固體樣品應(yīng)預(yù)先研細(xì)混勻,液體樣品應(yīng)振搖或攪拌均勻。固體樣品一般取樣范圍為0.20~2.00g;半固體試樣一般取樣范圍為2.00~5.00g;液體樣品取樣10.0~25.0mL(約相當(dāng)?shù)?0~40mg)。若檢測(cè)液體樣品,結(jié)果以g/100mL表示。

(2)樣品放入定氮管內(nèi)時(shí),不要沾附管頸上。

萬(wàn)一沾附可用少量水沖下,以免樣品消化不完全,結(jié)果偏低,或者用濾紙包裹好一起投入消化,濾紙影響通過(guò)空白扣除。若樣品不易消化至澄清透明,可將消化液稍冷卻,加入數(shù)滴過(guò)氧化氫后,再繼續(xù)加熱消化至完全。

(3)消化時(shí),不要用強(qiáng)火。應(yīng)注意消化溫度,用消解儀最好選擇曲線加熱,防止劇烈反應(yīng)導(dǎo)致樣品上沖附著在瓶壁上難以徹底消化。若樣品含糖高或含脂較多時(shí),注意控制加熱溫度,以免大量泡沫噴出,造成樣品損失。可加入少量辛醇或液體石蠟,或硅消泡劑減少泡沫產(chǎn)生。在整個(gè)消化過(guò)程中保持和緩的沸騰,使火力集中在消化管底部,以免附著在壁上的蛋白質(zhì)在無(wú)硫酸存在的情況下,使氮有損失。采用格丹納公司消解爐DS-360石墨孔內(nèi)加熱,階段升溫能夠很好地解決此問(wèn)題。

(4)如硫酸缺少,過(guò)多的硫酸鉀會(huì)引起氨的損失,這樣會(huì)形成硫酸氫鉀,而不與氨作用。因此,當(dāng)硫酸過(guò)多的被消耗或樣品中脂肪含量過(guò)高時(shí),要增加硫酸的量;加入硫酸鉀的作用是升高溶液的沸點(diǎn);催化劑硫酸銅在有機(jī)物全部消化后,溶液顯清澈透明的藍(lán)綠色,可用它來(lái)指示消化終點(diǎn)。此外,硫酸銅還可用做下一步蒸餾時(shí)堿性反應(yīng)的指示劑。過(guò)氧化氫為氧化劑,有助于有機(jī)物消化,同時(shí)可以消除消化 過(guò)程中的氣泡現(xiàn)象。

(5)向消化管中加入濃堿時(shí),往往出現(xiàn)褐色沉淀物,這是由于分解促進(jìn)堿與加入的硫酸銅反應(yīng),生成氫氧化銅,經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀。有時(shí)銅離子與氨作用,生成深藍(lán)色的結(jié)合[Cu(NH3)4]2+,加入氫氧化鈉是否足量,常常影響整個(gè)測(cè)定的順利進(jìn)行。由反應(yīng)原理可知,當(dāng)氫氧化鈉足量時(shí)有黑色氧化銅生成而使溶液呈淡黑色；當(dāng)氫氧化鈉量不足時(shí)就無(wú)黑色氧化銅產(chǎn)生而使溶液呈淡藍(lán)色,所以有無(wú)氧化銅顏色存在是判斷氫氧化鈉是否足量的標(biāo)志。

(6)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,因蒸餾時(shí)反應(yīng)室的壓力大于大氣壓力,故可將氨帶出。所以,蒸餾時(shí),蒸氣要發(fā)生均勻,充足,蒸餾中不得停火斷氣,否則, 會(huì)發(fā)生倒吸。傳統(tǒng)凱氏實(shí)驗(yàn)中,停止蒸餾時(shí),由于反應(yīng)室外層的壓力突然降低,可使液體倒吸入反應(yīng)室外層,所以,操作時(shí),應(yīng)先將冷凝管下端提離液面并清洗管口,再蒸一分鐘后關(guān)掉熱源。蒸餾是否完全,可用精密pH試紙測(cè)冷凝管口的冷凝液來(lái)測(cè)定,中性則說(shuō)明已蒸餾完全。一般情況下建議使用半微量法,因?yàn)槿绻麴s失敗的話,半微量法還可繼續(xù)蒸餾,而常量法只好全部重來(lái),費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

4.結(jié)論

凱氏定氮法作為目前的國(guó)標(biāo)方法與我們的工作密不可分,本文主要結(jié)合凱氏定氮儀測(cè)定樣品的具體實(shí)驗(yàn)討論了凱氏定氮法操作的細(xì)節(jié)及注意事項(xiàng);同時(shí)采用自動(dòng)凱氏定氮儀法測(cè)定粗蛋白,操作簡(jiǎn)單,快捷,高效,安全可靠,一次性可消化20個(gè)樣品,只需2~3h。蒸餾滴定一個(gè)樣品僅需5min左右便可得出結(jié)果,適用于批量樣品的測(cè)定。使用自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定氮及粗蛋白具有高的精密度和準(zhǔn)確性,對(duì)食品、飼料中的蛋白質(zhì)測(cè)定具有較強(qiáng)的實(shí)用性和可行性。